根据比尔定律,吸光度与试样浓度成正比,在不同的吸光度(Absorbance,Abs)范围内测量,可引起不同的误差.分析工作者应予高度重视.分析样品浓度太低或浓度太高,吸光度值超越了合适的范围,都不会得到满意的结果.应使被分析样品的吸光度范围控制在一个合理的范围内.
试样浓度不能太低,吸光度不能太小,信号过小,光度噪声的影响较大,使仪器的信噪比下降,被测试的试样浓度下限增高和分析误差增大,如测试黄曲霉素,因仪器的噪声太大,测试数据从0.4Abs开始就超过1%的相对误差.
当光度噪声大到一定程度、吸光度小到一定程度时,吸光度就根本不与样品的浓度成正比.甚至会产生试样浓度变稀时,吸光度值反而增大(噪声所致),以致无法得到稳定的测量数据.在常规分析时,对大多数试样浓度大多取10~100μg/ml,相当0.3~0.7Abs左右为最佳.
试样也不能太浓,吸光度也不能太大,如果试样的吸光度太大,因为杂散光的原因,使分析测试结果严重偏离比耳定律,可能会使分析误差增大.甚至会产生试样浓度增大时,吸光度值反而减小等反常现象.杂散光可能使分析测试结果的数据偏小,也可能偏大;若测试波长以外的杂散光被试样吸收则测量数据偏小,若测试波长杂散光不被试样吸收则测量数据偏大.
在试样量允许时,试样应选择靠近最佳吸光度值(0.434Abs)的浓度.从理论上讲,吸光度值为最佳值0.434Abs时,分析误差最小.如果被测试样太浓时,应向靠近0.434Abs的方向稀释.在不同的吸光度上测试,相对误差和绝对误差都不同.按照目前国际上一般高档紫外可见分光光度计给出的ΔT=±0.3%T,笔者测试的结果见表6-3.测试在不同浓度或不同吸光度的相对误差列于表6-4.